DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA SARS-COV-2: RT-PCR E SOROLOGIA

Por Alessandro França - abril 24, 2020

Para o diagnóstico laboratorial a RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) é considerado padrão-ouro para o diagnóstico do SARS-CoV-2, pois o método permite a confirmação dos casos de COVID-19, a partir do processamento do material genético do vírus. Nos infectados o teste de confirmação da COVID-19 levam cerca de 6 dias para a validação da amostra. Além disso, os testes rápidos estão sendo amplamente utilizados para o diagnóstico laboratorial da COVID-19, pois a utilização de anticorpos específicos confere uma grande sensibilidade.

Como dito anteriormente, o Gold Standard para o diagnóstico laboratorial é a RT-PCR. A técnica fornece a identificação do material genético do vírus. Como o SARS-CoV-2 é um vírus de RNA, antes da realização do processo de análise do material genético, faz necessário a utilização da reação da transcriptase reversa para converter o RNA em DNA e, em seguida a PCR processa a cadeia de nucleotídeo gerada. A RT-PCR amplifica o material genético para assim possibilitar sua análise e identificação. Contudo, há alguns fatores que podem interferir na sensibilidade dessa técnica, dificultando a interpretação do resultado, e assim, favorecendo a resultados falso-negativos ou falso-positivos. 
Figura 1: Processo do RT-PCR a partir de uma amostra. Inicialmente, células ou tecidos (cells and tissues) são preparados para a extração e purificação do material genético, que  neste caso é o RNA mensageiro (mRNA). Após a purificação, a transcriptase reversa e o mRNA são usados em adição aos reagentes padrões de PCR. A mistura da reação é aquecida a 37ºC permitindo a produção de cadeias de DNA complementar (cDNA). Primers específicos se ligam ao cDNA iniciando o primeiro clico (First cycle PCR) de amplificação.
A sensibilidade dessa técnica pode ser diminuída em função de uma baixa carga viral, além de apresentar algumas considerações a respeito da coleta da amostra, do tempo em relação a coleta e a disponibilização do resultado. Apesar das amostras mais utilizadas serem o swab de nasofaringe ou orofaringe, essas e outras amostras apresentam sensibilidade quanto a detecção do vírus. De acordo com o estudo realizado por Wang, et al. (2020), foi analisado a sensibilidade de 1070 amostras que correspondiam a 250 pacientes com a COVID-19, em que obtiveram os seguintes resultados: lavado broncoalveolar 93%, escarro 72%, swab nasal 63%, swab de orofaringe 32%, fezes 29%, sangue 1% e urina %.

Além disso, é evidente que a carga viral pode sofrer oscilações ao longo do tempo e, portanto, acaba influenciando na detecção do vírus pela técnica de RT-PCR. Não só esse, como outros fatores podem influir no resultado da RT-PCR, sendo necessário a coleta de diversas amostras de locais e períodos diferentes durante o decorrer da doença. Por isso, é essencial os cuidados na coleta da amostra e durante o processo da RT-PCR. Para que os laboratórios executem a RT-PCR, deve-se certificar dados com outros laboratórios de referência ligados a CGLAS (Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública), pois é fundamental para a validação dos resultados.

Após a aprovação pela ANVISA, por meio da resolução RDC n° 348, de março de 2020, a utilização dos testes rápidos aumentou, uma vez que a situação atual é considerada emergência de saúde pública. Os testes sorológicos, também conhecidos como testes rápidos, são empregados pela busca de anticorpos específicos produzidos pelo nosso organismo em resposta a infecção ou pela pesquisa de antígenos. Tendo em vista o tempo de janela imunológica, isto é, o tempo de produção dos anticorpos, os testes sorológicos são aplicados 10 dias após a apresentação dos sintomas da COVID-19 e, geralmente, as amostras solicitadas para a realização dos testes rápidos são o sangue total, soro ou plasma. 

Dentre os anticorpos produzidos, as imunoglobulinas G e M são as mais utilizadas para a detecção da resposta imunológica da COVID-19, e foram utilizadas separadamente para a avaliação da doença. Entretanto, por apresentar uma melhor especificidade e sensibilidade maior (respectivamente, 91% e 89%), recentemente tem-se usado o imunoensaio combinando IgM-IgG. Os resultados obtidos desses e de outros testes sorológicos são dados valiosos diante da pandemia, o que torna sua aplicação ainda mais importante para a vigilância epidemiológica.

Portanto, tanto os testes sorológicos, quanto a RT-PCR, são utilizados para o diagnóstico laboratorial, sendo a RT-PCR padrão-ouro para o diagnóstico confirmatório da COVID-19. Embora os testes sorológicos não sejam confiáveis para a confirmação dos casos, sua contribuição para o diagnostico laboratorial é indispensável. Devido a alta especificidade desses métodos, a presença de resultados positivos se tornam para o diagnóstico de infecção pelo SARS-CoV-2.



           
Referências/Fontes
Corman Victor M., et. al (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

Lippi, G., & Plebani, M. (2020). The critical role of laboratory medicine during coronavirus disease 2019 (COVID-19) and other viral outbreaks, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) (published online ahead of print), 20200240. https://doi.org/10.1515/cclm-2020-0240

BRASIL. Ministério da Saúde. Diretrizes para o diagnóstico e tratamento da COVID-19, versão 2. Secretaria de Ciência, Tecnologia Inovação e Insumos Estratégicos em Saúde. 2020.

Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC). Diagnóstico laboratorial do coronavirus (SARS-CoV-2) causador da Covid-19 (2020). Disponível em: http://www.sbac.org.br/blog/2020/03/30/diagnostico-laboratorial-do-coronavirus-sars-cov-2-causador-da-covid-19/.

Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC). Métodos laboratoriais para o diagnóstico da COVID-19 (2020). Disponível em: http://www.sbac.org.br/blog/2020/03/25/metodos-laboratoriais-para-diagnostico-da-covid-19/

Wang, W. et al. (2020). Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens, JAMA Network Open. https://doi.org/10.1001/jama.2020.3786

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