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IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS

A família enterobacteriaceae é uma das mais importantes famílias bacterianas, compreende muitos dos patógenos mais isolados para o homem e os animais. Esses patógenos estão entre os principais agentes de infecção hospitalar e constituem a principal causa de infecção intestinal em muitos países.

As enterobacteriáceas são bacilos Gram-negativos cujas células apresentam membrana citoplasmática, espaço periplásmico, peptideoglicano ou mureína e membrana externa. A maioria apresenta filamento flagelar que nasce no citoplasma e muitas possuem cápsulas ou estrutura tipo capsular conhecidas como antígenos K. A membrana externa contém o LPS, porinas e diferentes tipos de fímbrias. Diferentes tipos de plasmídeos são transportados por muitas amostras. O cromossomo é único e circular. Fisiologicamente as enterobacteriáceas são microorganismos anaeróbios facultativos, reduzem nitrato a nitrito, fermentam  a glicose e são oxidase- negativas. São capazes de metabolizar uma ampla variedade de substâncias como carboidratos, proteínas e aminoácidos, lipídeos e ácidos orgânicos. Produzem catalase, utilizam glicose e amônia como fontes únicas de carbono e nitrogênio, respectivamente. Estas propriedades metabólicas são extensivamente usadas na classificação e identificação dos gêneros e espécies da família.

As enterobacteriáceas apresentam ou produzem uma gama enorme de fatores de virulência comprovados e potenciais. A maioria destes fatores de virulência é expressa pelas variedades patogênicas de E. coli, Shigella, Salmonella e Yersinia. As infecções causadas por essa família podem ser intestinais ou extra- intestinais, essas últimas podem ser localizadas ou sistêmicas. As infecções localizadas mais frequentes são as das vias urinárias, dos pulmões, do sistema nervoso central, da pele e do tecido celular subcutâneo (feridas). Tanto as infecções intestinais como as extra-intestinais podem permanecer localizadas ou se transformarem em infecções sistêmicas; as bacteremias são bastante frequentes. O diagnóstico das infecções tem por base o isolamento da enterobactéria e sua identificação. O isolamento não oferece dificuldade, pois estes microorganismos crescem bem nos meios de cultura simples sólidos e líquidos e também em meios seletivos como o de MacConkey, bastante usado em diagnóstico. As bactérias frequentemente isoladas podem ser facilmente identificadas por conta das suas características culturais e um número limitado de provas bioquímicas. Alguns exemplos de características muito úteis em identificação que podemos ressaltar são:
Odor do crescimento: Proteus mirabilis exala odor de putrefação. Providencia sp. exala intenso odor adocicado. Esses odores dependem de produtos de metabolismo das diferentes espécies.
Morfologia das colônias: Em placas de MacConkey, E. coli e Klebsiella pneumoniae formam colônias altamente sugestivas das espécies. Já em placa de ágar sangue Proteus mirabilis tem um crescimento em forma de véu bastante característico. Esse véu se deve a forma de crescimento, que ocorre em ciclos, devido à variação da quantidade de flagelos expressos pela célula bacteriana.
Pigmentação: Serratia marcescens produz pigmento vermelho.
Testes bioquímicos: São meios de cultura sólidos ou líquidos distribuidos em tubos de ensaio ou em diferentes modalidades de kits. Vale ressaltar os testes mais utilizados na rotina dos laboratórios de microbiologia:

Meio EPM (Escola Paulista de Medicina) fornece quatro reações bioquímicas:
Produção de gás. A enzima hidrogenilase fórmica (formiase) desdobra o ácido fórmico (um dos ácidos produzidos durante a fermentação da glicose) em CO2 e H2. O gás é evidenciado pela presença de bolhas, rachaduras e/ou  deslocamento do meio da sua posição original no tubo.
Produção de H2S. A enzima tiossulfato-redutase age sobre o tiossulfato de sódio, produzindo H2S, o qual é evidenciado através da reação com o citrato férrico amoniacal, que originará um sulfeto de ferro insolúvel de cor negra.
Hidrólise da ureia. A urease desdobra a uréia em CO2 e NH3, o qual se dissolve sob a forma de carbonato de amônia, alcalinizando o meio. Neste caso, a base do meio fica azul.
Triptofano desaminase. A enzima L-triptofano desaminase (LTD) promove a desaminação oxidativa do aminoácido L-triptofano, convertendo-o em ácido indol pirúvico, o qual reage com sais de ferro originando um composto cíclico de cor verde escura. Outro aminoácido muito utilizado no teste é a fenilalanina, cujo produto final da desaminação é o ácido fenilpirúvico. A desaminação ocorre em aerobiose, sendo observada  no ápice do meio EPM.

Meio MILI (motilidade, indol e lisina):
Motilidade. A bactéria móvel cresce além da linha de inoculação, turvando parcial ou totalmente o meio; enquanto a bactéria imóvel cresce somente onde foi inoculada, deixando o meio translúcido.
Indol. A enzima triptofanase age sobre o triptofano, resultando na liberação do indol. Esta reação é evidenciada pela adição do reativo de kovacs, produzindo uma coloração rosa- avermelhada.
Lisina descarboxilase (LDC). A LDC promove a remoção do CO2 da lisina, produzindo uma amina (cadaverina) e alcalinizando o meio, que adquire a cor púrpura em toda a sua extensão.Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire a cor amarela no seus dois terços inferiores.

Ágar Tríplice Açúcar. Usado para determinar a habilidade de um microorganismo em utilizar carboidratos específicos existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S.
- Fermentação da glicose. A concentração de glicose no meio é de apenas 0,1%, obtendo-se assim uma quantidade relativamente pequena de ácido. Inicialmente, todo o meio se torna amarelo devido a degradação da glicose. Após algumas horas, os microorganismos começam a decompor oxidativamente a peptona, produzindo uma alcalinização na superfície do meio. No fundo do tubo, a degradação protéica é insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, e o meio mantém-se amarelo. Todas as enterobactérias fermentam a glicose.
- Fermentação da lactose e da sacarose. O meio possui uma concentração maior desses açúcares (10%), permitindo que as bactérias que utilizam a lactose com ou sem sacarose, produzam quantidades relativamente altas de ácidos, suficiente para superar a reação alcalina desenvolvida na superfície do meio. O tubo permanece totalmente com coloração amarela. O indicador de pH do meio é o vermelho de fenol.

- Produção de gás. Ocorre formação de gás devido a degradação de moléculas de ácido fórmico, sendo evidenciado pelo aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio.

- Produção de H2S. É evidenciada pelo aparecimento de um precipitado de coloração negra (sulfeto de ferro), proveniente da reação do H2S com o sulfato férrico amoniacal contida no meio.

Outros testes:
- Citrato de sódio. É um composto orgânico simples encontrado como um dos metabólicos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo de krebs). Algumas bactérias podem obter energia utilizando citrato como única fonte de carbono. Esta característica é importante para identificação de alguns membros de enterobacteriaceae: E. coli é citrato negativo, enquanto as espécies de Enterobacter e klebsiella são positivas. O meio a ser empregado para o teste inclui citrato de sódio e fosfato de amônia como única fonte de carbono e nitrogênio e deve ser isento de proteínas e carboidratos. As bactérias que produzem enzima citratase conseguem utilizar o citrato como única fonte de carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo amônia, alcalinizando o meio. O indicar utilizado é azul do bromotimol, que em pH ácido é amarelo/verde e em pH alcalino é azul.

- Fenilalanina desaminase. A desaminação de fenilalanina forma ácido fenilpirúvico. Entre os membros da família Enterobacteriaceae, apenas as espécies de Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima necessária para a desaminação de fenilalanina. Um teste consiste na detecção de ácido fenilpirúvico, após crescimento do microorganismo em meio contendo o aminoácido. O aparecimento de uma coloração verde escura após adição de uma solução de cloreto férrico a 10% indica resultado positivo.


VEJA ALGUMAS IMAGENS

1.TSI: Gás +/ Glicose +/ Lactose+/ H2S -
2.EPM: Uréia -/ LTD -
E. coli em meio de MacConkey
TSI: LACTOSE-/ GLICOSE+/ GÁS +
Klebsiella spp. em meio de MacConkey

Provas bioquímicas: TSI, EPM, MILI, MIO, CITRATO, FENILALANINA
Fenilalanina +/ Fenilalanina -





Referência/fonte
Imagem/foodpoisoningnews/Arquivopessoal