DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE TUBERCULOSE

Por Unknown - fevereiro 29, 2016

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, bastonete delgado e aeróbico obrigatório. Sua parede celular assim como a de outras micobactérias é composta por grande quantidade de lipídios, estes garantem resistência a estresses ambientais e aos antimicrobianos químicos usados como antissépticos e desinfetantes.

A composição da parede celular também é responsável por classificar esses microrganismos como álcool ácido resistentes (B.A.A.R.), pois ao serem corados com carbol-fucsina não podem ser descorados com ácido ou álcool.

As pessoas infectadas apresentando TB respondem com imunidade mediada por células contra a bactéria. Essa forma de resposta imunológica se desenvolve, em lugar da imunidade humoral, porque o patógeno está localizado principalmente dentro dos macrófagos. Essa imunidade, envolvendo células T sensibilizadas, é a base para o teste cutâneo de tuberculina, um teste de triagem para a infecção. Um teste positivo não indica necessariamente doença ativa. Nesse teste, uma proteína purificada derivada da bactéria da TB, obtida por precipitação de culturas em caldo, é injetada cutaneamente. Se a pessoa injetada foi infectada com TB no passado, as células T sensibilizadas reagem com essas proteínas e ocorre uma reação de hipersensibilidade tardia, em cerca de 48 horas. Essa reação surge como uma induração (endurecimento) e avermelhamento da área em torno do local de injeção. Provavelmente, o teste mais preciso de tuberculina é o teste de Mantoux, no qual diluições de 0,1 mL de antígeno são injetadas, e a área reativa da pele é medida.

Um teste de tuberculina positivo em crianças muito pequenas é uma indicação provável de um caso ativo de TB. Em pessoas mais velhas, pode indicar somente a hipersensibilidade resultante de uma infecção prévia ou vacinação, e não um caso atualmente ativo. Contudo, é uma indicação de que exames subsequentes são necessários, como um raio X de tórax ou uma TC para a detecção de lesões pulmonares, além de tentativas de isolar a bactéria.

O passo inicial no diagnóstico laboratorial de casos ativos é um exame microscópico de esfregaço, utilizando o escarro. Esse pode ser um exame convencional com coloração álcool-ácida (coloração de Ziehl Neelsen) ou o teste mais específico de microscopia com anticorpos fluorescentes. A confirmação da TB pelo isolamento da bactéria é complicada pelo crescimento muito lento do patógeno. A formação da colônia pode levar de três a seis semanas, com o término de uma série confiável de identificação levando outras três a seis semanas.

Tem havido considerável progresso no desenvolvimento de testes de diagnóstico rápido, sondas de DNA estão disponíveis para identificar isolados cultivados. Diversos novos testes têm sido introduzidos, utilizando métodos de PCR, que são capazes de detectar M. tuberculosis diretamente do escarro ou de outras amostras. Muitos testes novos detectam a presença de interferon gama (IFN-γ) em amostras de sangue, o qual é liberado pelas células T em resposta a certos antígenos de M. tuberculosis. Há evidências de que, em comparação ao teste cutâneo, este novo teste possui muito mais especificidade e menor reatividade cruzada com a vacinação BCG. Porém, ele não distingue infecção latente de infecção ativa.

Contudo, estes testes parecem ser realidade distante da rotina da grande maioria dos laboratórios clínicos, o que torna o teste cutâneo de tuberculina e o exame microscópico de esfregaço os testes eleitos para diagnóstico de TB, associados aos sinais e sintomas clínicos apresentados pelo paciente.

Segue abaixo o procedimento de coloração Zielh- Neelsen disponibilizado pela ANVISA:

Solução de carbolfucsina
– Fucsina básica . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 g
– Álcool etílico a 95% . . . . . . . . . . 10 mL
– Cristais de fenol derretidos . . . 5 mL
– Água destilada . . . . . . . . . . . . . . 95 mL
      • Dissolver a fucsina básica no álcool e o fenol na água. Misturar as duas soluções.
      • Deixar repousar por vários dias antes de usar ácido-álcool.
– Álcool etílico . . . . . . . . . . . . . . . . 97 mL
– Ácido clorídrico concentrado 3 mL Coloração de fundo (azul-de-metileno)
– Azul-de-metileno . . . . . . . . . . . . 0,3 mL
– Água destilada . . . . . . . . . . . . . . 100 mL

Execução
Bacilos álcool ácido resistentes corados pelo método de
 Ziehl Neelsen, objetiva de 100x, material escarro.
– Cobrir a superfície da lâmina com a solução de carbolfucsina.
– Aquecer a lâmina coberta com o corante, lentamente com auxílio de um bico de Bunsen, até a emissão de vapores, tomando o cuidado para não deixar ferver.
– Aquecer com calor baixo ou intermitente por um período de três a cinco minutos.
– Deixar a lâmina esfriar. 
– Lavar a lâmina com água corrente. 
– Cobrir a lâmina com solução de álcool – ácido a 3% e descorar o esfregaço até que o corante não drene mais da lâmina. 
– Lavar a lâmina com água corrente e esgotando todo resíduo da mesma. 
– Cobrir a lâmina com o corante de contraste (azul de metileno), por 20 a 30 segundos. 
– Lavar a lâmina com água corrente e deixar secar naturalmente sem forçar com papel de filtro.
– Examinar o esfregaço com objetiva de imersão no aumento de 100x.











Referências/fontes:
Imagem/crédito: Pixabay
Tabela: Coloração de Ziehl-Neelsen. Universidade Federal de Minas Gerais.
TORTORA, Gerard J; FUNKE. Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. ed. 10. Porto Alegre: Artmed, 2012.ANVISA. Módulo 4: Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica e Laudo Final.

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